周昌是沛县人，他和堂兄周苛都在秦时担任泗水卒史。等到汉高祖在沛县起兵的时候，打败了泗水郡的郡守、郡监，这样，周昌、周苛二兄弟也就以卒史的资历追随刘邦，刘邦命周昌掌管旗帜，周苛暂时在账下当宾客。后来他们都跟从刘邦入关，推翻强秦的统治。刘邦被封为汉王，汉王任命周苛为御史大夫，周昌为中尉。

汉王四年（公元前203年），楚军在荥阳把汉王团团围住，情况紧急，汉王悄悄出逃，命令周苛留守荥阳城。楚军攻破了荥阳，想任命他为将领，周苛痛斥道：“你们这些人应该赶快投降汉王，不然的话，很快就要做俘虏了！”项羽听罢大怒，立刻就烹杀了周苛。于是，汉王就拜周昌为御史大夫。周昌经常跟随汉王，并且多次击败项羽军。因此，在高祖六年（公元前201年）时，周昌和萧何、曹参一起受封，周昌被封为汝阴侯，周苛的儿子周成因父亲为国捐躯的原因，也被封为高景侯。

周昌为人坚韧刚毅，敢于直谏。萧何、曹参等人对周昌都非常敬畏。周昌曾经有一次在高帝休息时进宫奏事，高帝正和戚姬拥抱，周昌见此情景，回头便跑，高帝连忙上前追赶，追上之后，骑在周昌的脖子上问道：“你看我是什么样的皇帝？”

周昌挺直脖子，昂起头说：“陛下您就是夏桀、商纣一样的皇帝！”高帝听了哈哈大笑，但是却由此最敬畏周昌。

等到高帝想废掉太子、立戚姬之子如意为太子时，许多大臣都坚决反对，但是都未奏效。后来，幸好张良为吕后定下计策，使高帝暂时把此事放下。而周昌在朝廷中和皇帝极力争辩，高帝问他理由何在，因为周昌本来就有口吃的毛病，再加上是在非常气愤的时候，也就口吃得更加厉害了，他说：“臣口不能言，然臣期期知其不可；陛下虽欲废太子，臣期期不奉诏。”

高帝听罢，高兴地笑了。吕后因为在东厢听到上述对话，事后她见到周昌时，就跪谢他的据理力争。

此后，戚姬的儿子如意立为赵王，年仅十岁，高祖担心如果自己死后，赵王会被人杀掉。当时有一个名叫赵尧的人，年纪很轻，他的官职是掌管符玺的御史。

赵尧就出主意说最好为赵王派去一个地位高贵而又坚强有力的相国，这个人还得是吕后、太子和群臣平素都敬畏的人才行，并说只有御史大夫周昌才能担此重任。高祖于是就让周昌去辅佐赵王，担任赵王的相国。周昌虽不愿去，却也只得听令。

周昌走了以后，高祖果然就任命赵尧为御史大夫。赵尧在以前也有军功和食邑，等到他攻打陈豨立了功后，就被封为江邑侯。

高祖去世之后，吕太后派使臣召赵王入朝，相国周昌让赵王推说身体不好，不能前往。使者往返去了三次，周昌都一直坚持不送赵王进京。于是吕后很是忧虑，就派使者召周昌进京。

周昌进京之后，拜见吕后，吕后非常生气地骂他：“难道你还不知道我非常恨戚夫人吗？而你却不让赵王进京，为什么？”

周昌被召进京城之后，吕后又派使者召赵王，不久，赵王来到了京城。他到长安一个多月，就被逼喝下毒药死去了。周昌因此也就称病隐退，不再上朝拜见太后。三年之后，他也去世了。